زراعيون بلا حدود::تحديد# السالمونيلا #في# الأغذية#

تحديد# السالمونيلا #في# الأغذية#

البحث وتحديد السالمونيلا في الأغذية

 1. الغرض ومجال التطبيق

 تستخدم هذه الطريقة لاكتشاف السالمونيلا الحية في الغذاء.  تنطبق إجراءات خاصة على أطعمة معينة * ، كما هو موضح في وضع التشغيل.

 * لاحظ أن مصطلح الطعام يشمل أيضًا الماء.

 2. المبدأ
 تتكون المنهجية المستخدمة لعزل والتعرف على بكتيريا السالمونيلا من الأطعمة من 6 خطوات:

 التخصيب المسبق في وسط غير انتقائي
 يتم بذر العلف في وسط مغذي غير مثبط.  تسمح هذه الخطوة باستعادة بكتيريا السالمونيلا التي خضعت لقيود فيزيائية أو كيميائية (المعالجة الحرارية ، التجميد ، الجفاف ، المواد الحافظة).

 الإثراء في وسط انتقائي
 يتم زرع بذور ما قبل التخصيب في وسط غذائي يحتوي على عوامل مثبطة نشطة على الكائنات الحية التي تنافس السالمونيلا.

 الثقافة على الوسط الانتقائي والتفاضلي
 يتم رسم ثقافات الإثراء الانتقائي على أغار انتقائية تمنع نمو البكتيريا المنافسة وتسمح بالفحص البصري لمستعمرات السالمونيلا المفترضة.

 􀂃 تنقية العزلات (اختياري)
 يتم تنقية عزلات السالمونيلا المشتبه بها على أجار تفاضلي.

 الكيمياء الحيوية للسلالات المختارة
 تسمح هذه الخطوة بالتعريف الكيميائي الحيوي للبكتيريا التي يُفترض أنها السالمونيلا.

 􀂃 الأمصال
 تتيح هذه الخطوة تحديدًا أكثر تحديدًا للسلالة باستخدام مضادات جسدية متعددة التكافؤ ومضادات تجميع جسدية.  يتم إرسال السلالات إلى مركز متخصص لكتابة كاملة.

 2. وسائل الإعلام وكواشف الثقافة
 2.1 الإعلام الثقافي
 يجب تحضير الوسائط والكواشف التالية وفقًا للتعليمات الواردة في الملحق أ.

 􀂃 مياه الببتون المخزنة (EPT) (A-1)
 مرق سيلينيت سيستين (SC) (A-2)
 􀂃 مرق يحتوي على رباعي تراثيونات أخضر لامع (TBG) (A-3)
 􀂃 رابابورت - فاسيلياديس مرق الصويا (RVS) (A-4)
 􀂃 أجار كبريتيت البزموت (BS) (A-5)
 􀂃 هيكتوين أجار (سعادة) (أ -6)
 􀂃 XLD أجار (A-7)
 􀂃 XLT4 أجار (A-8)
 􀂃 MacConkey (TM) Agar (A-9)
 􀂃 آجار الحديد ثلاثي السكر (A-10)
 􀂃 ليسين الحديد أجار (LIA) (A-11)
 􀂃 BHI Agar (A-13)
 􀂃 سلفابيريدين أجار مع إضافة اللون الأخضر اللامع (BG sulfa) (A-14)

 2.2 الكواشف
 􀂃 Antisera للسالمونيلا (A-12)
 􀂃 محلول 1N NaOH و 1N HCl

 3. الجهاز
 3.1 الأجهزة

 􀂃 المحرض (دوامة) - اختياري
 ميزان تحليلي ذو سعة كافية بقابلية قراءة تبلغ 0.1 جرام.

 􀂃 جهاز تخفيف أوتوماتيكي (مثال: Dilumat من مختبر AES) اختياري

 􀂃 فرن أو حمام مائي بدرجة حرارة 35.0 ± 1.0 درجة مئوية و 42.5 ± 0.5 درجة مئوية

 􀂃 الخالطون:
 (أ) نوع تمعجي (Stomacher) ، بأكياس بلاستيكية معقمة ،
 أو
 (ب) من النوع الدوار بأوعية زجاجية أو معدنية مزودة بأغطية مقاومة لظروف التعقيم.
 لوح تسخين مزود بتقليب (قضبان مغناطيسية)

 􀂃 ثلاجة عند 2.0 ± 2.0 درجة مئوية
 􀂃 مجسم بخلفية داكنة وشرائح زجاجية
 􀂃 معقم الحرارة الرطب (الأوتوكلاف)
 3.2 المعدات والمنتجات الخاصة
 حلقة التلقيح وسلك البذور ، من البلاتين المشع أو النيكل الكروم أو البلاستيك.
 أطباق بتري معقمة (100 × 15 مم)
 􀂃 موقد غاز
 􀂃 ورق الأس الهيدروجيني (6.0 إلى 7.0)
 ماصات مصلية معقمة 10.0 مل متدرجة بوحدات 0.1 مل و 2.00 مل ماصات مدرجة في وحدات 0.01 مل.
 􀂃 سلالات السيطرة: السالمونيلا المصلي ماتوبيني والسالمونيلا المصلي التيفيموريوم.
 أدوات معقمة
 􀂃 أنابيب الثقافة

 4. أخذ العينات وتحضير العينات

 يتم تحليل العينات في أقرب وقت ممكن بعد وصولها إلى المختبر.  بشكل عام ، يرجى الرجوع إلى الوثيقة 01-D-550 لإعداد العينة.
 4.1 تحضير المجانسة والتخصيب في وسط غير انتقائي.
 4.1.1 جمع معقمًا معقمًا أجزاء مختلفة من المنتج لتحليلها.  إذا كانت العينة سائلة ، قم برجها بقوة (قلب الحاوية 25 مرة) أو حتى تمتزج المحتويات.
 4.1.2 تزن 25.0 ± 0.5 جم على الميزان العادي أو 25.0 ± 1.0 جم بمخفف العينة الأوتوماتيكي عن طريق إضافتها إلى كيس بولي إيثيلين أو وعاء زجاجي مُغطى مسبقًا.  تابع الخطوات الواردة في النقطة 9.
 4.1.3 لاكتشاف السالمونيلا في الماء ، يجب ترشيح حجم 4 لترات من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر Millipore HA.  ثم يتم وضع الغشاء في 225 مل من ماء الببتون المخزن (EPT).  احتضان عند 35 ± 1 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة.

 5. الإجراء

 5.1 التخصيب المسبق في وسط غير انتقائي
 5.1.1 قم بإعداد تخفيف 1:10 للطعام عن طريق إضافة معقم يدويًا أو باستخدام جهاز التخفيف التلقائي 225 مل من ماء الببتون المخزن (EPT) إلى الوحدة التحليلية التي تم وزنها مسبقًا  .
 ملاحظة 1: في حالة منتجات الألبان المجففة ، قم بإعداد معلق بوضع 25 جم من المسحوق في 225 مل من الماء المقطر.  أضف 0.5 مل من محلول صبغة خضراء لامع 1٪.  هز كل شيء للحصول على تعليق موحد.
 ملحوظة 2: عادة ما يتم إذابة التوابل والتوابل مع مرق المغذيات بنسبة 1: 10. ومع ذلك ، يجب إذابة بعض التوابل التي تكون مبيد للجراثيم أو التي تمتص جزءًا كبيرًا من المرق بنسب أكبر.  (انظر الجدول 1 ، الملحق ب)
 5.1.2 تخلط مع Stomacher أو المجانسة الدوارة لمدة دقيقتين تقريبًا أو حتى يتم الحصول على خليط متجانس.  تجنب التسخين المفرط للمجانسة.
 5.1.3 في حالة الشك ، تحقق من الرقم الهيدروجيني للخليط عن طريق نقل قطرة تعليق بطريقة معقمة إلى ورقة مؤشر الأس الهيدروجيني.  اضبط ، إذا لزم الأمر ، إلى pH بين 6.0 و 7.0 مع 1N NaOH أو 1N HCl.
 5.1.4 لكل سلسلة من العينات ، تم استنبات السالمونيلا المصل.  تمت إضافة Matopeni كعنصر تحكم إيجابي.  هذه السلالة ، غير موجودة بشكل كبير في كندا ، يمكنها الكشف بسرعة عن مشاكل التلوث ، إن وجدت.  ثم احتضانها عند 35 ± 1 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
 5.2.  الإثراء في وسط انتقائي
 5.2.1 انقل 0.1 مل و 1.0 مل من ثقافة ما قبل التخصيب إلى 10 مل من مرق RVS و TBG ، على التوالي.  إذا تم استخدام SC ، انقل 1.0 مل إلى 10 مل من المرق.
 ملحوظة: ينصح باستخدام مرق السيلينيت- سيستين لعزل السالمونيلا.  Typhi و Paratyphi.
 5.2.2 احتضان مرق TBG و RVS عند 42.5 ± 0.5 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.  إذا تم استخدام مرق SC ، احتضان عند 35.0 ± 1.0 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.

 5.3 الثقافة على أجار انتقائي
 5.3.1 بعد الحضانة ، تلقيح حلقة واحدة من كل مرق انتقائي على أجار كبريتيت البزموت (BS) وعلى XLD للحصول على المستعمرات المعزولة جيدًا.  يمكن أيضًا رش مزارع التخصيب على أجار أخرى (XLT4 ، Hektoen ، BG sulfa) لعزل السالمونيلا إذا لزم الأمر.
 ملحوظة 1: أجار البزموت كبريتات (BS) له تأثير مثبط للغاية على غالبية الأنماط المصلية للسالمونيلا إذا تم استخدامه طازجًا.  يجب تخزين Agar طوال الليل عند 4.0 درجة مئوية وحمايته من الضوء قبل الاستخدام.
 ملاحظة 2: قم بتخزين مرق RVS و TBG و SC في الثلاجة ، لاستئناف التلقيح على أجار BS و XLD إذا لم تكن هناك مستعمرات معزولة جيدًا أو إذا كانت هناك حاجة لانتظار نتائج  الكشف عن السالمونيلا بواسطة PCR.

 5.3.2 احتضان اللوحات عند 35.0 ± 1.0 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.  إذا لم تكن هناك مستعمرات تشير إلى وجود السالمونيلا على BS Agar ، فاحضن الأطباق لمدة 24 ± 2 ساعة إضافية.
 احتضان (إذا تم استخدامه) أجار HE و BG sulfa و XLT4 عند 35.0 درجة مئوية لمدة 18 إلى 48 ساعة اعتمادًا على النمو والملاحظات.
 5.3.3 افحص اللوحات بحثًا عن مستعمرات السالمونيلا المشتبه بها:
 􀂃 BS Agar: تظهر مستعمرات السالمونيلا النموذجية باللون الأسود أو البني الداكن مع أو بدون لمعان معدني ، على وسط محيط بني في بداية التفاعل ويصبح داكنًا عند فترة الحضانة الطويلة.  قد تظهر سلالات غير نمطية معينة (مثل S. enterica subsp. Arizonae) التي تخمر اللاكتوز و (أو) السكروز ، مستعمرات خضراء مع أو بدون تغميق الوسط.
 􀂃 BG sulfa agar: عادة ما يختلف لون مستعمرات السالمونيلا المميزة من الوردي إلى الفوشيا ويتحول الوسط المحيط إلى اللون الأحمر.
 􀂃 أجار HE: مستعمرات السالمونيلا النموذجية لها لون أخضر مزرق مع أو بدون مركز أسود.  هذا يمكن أن يتوسع ويحول المستعمرة إلى اللون الأسود تمامًا.  تنتج بعض السلالات غير النمطية مستعمرات صفراء مع أو بدون مركز أسود.
 􀂃 XLD Agar: مستعمرات السالمونيلا النموذجية لها لون وردي أحمر شفاف ، مع أو بدون مركز أسود.  هذا يمكن أن يتوسع ويحول المستعمرة إلى اللون الأسود تمامًا.  عمل ديكاربوكسيلاز ليسين يجعل الوسط أكثر قلوية وأرجوانية اللون.  تنتج بعض سلالات السالمونيلا غير النمطية مستعمرات صفراء بمركز أسود أو بدونه.
 􀂃 XLT4 Agar: مستعمرات السالمونيلا النموذجية (H2S +) لها لون أسود أو مركز أسود بهالة صفراء بعد 18-24 ساعة من الحضانة.  بعد فترة حضانة طويلة ، تتحول المستعمرات تمامًا إلى اللون الأسود أو الوردي مع مركز أسود.  Salmonella H2S - يتحول إلى اللون الوردي إلى الأصفر.
 ملحوظة: يتطلب التحقيق في مستعمرات السالمونيلا خبرة ، وبما أن خصائصها على وسيط تحديد تختلف من سلالة إلى سلالة ، يجب اختيار المستعمرات المشتبه بها مثل المستعمرات النموذجية لمزيد من الاختبارات الكيميائية الحيوية.  .
 إذا لم تكن هناك مستعمرات مشبوهة من السالمونيلا على ألواح أجار ، فإن بكتيريا جنس السالمونيلا تعتبر غائبة عن وحدة التحليل.

 5.4 تنقية العزلات
 5.4.1 من الأجار الانتقائي ، ضع المستعمرات المشتبه بها على ألواح أجار MacConkey للتنقية.  يمكن زرع أجار XLD إذا كان من الصعب الحصول على مستعمرات معزولة أو إذا كان توصيف المستعمرات غير واضح.
 5.4.2 احتضان لوحات أجار عند 35.0 ± 1.0 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
 مستعمرات السالمونيلا النموذجية سلبية اللاكتوز وعديمة اللون في MacConkey.  ومع ذلك ، فإن تلك الأنماط الحيوية الإيجابية للاكتوز تكون وردية.

 5.5 الكيمياء الحيوية السلالة
 5.5.1 يتم تلقيح المستعمرات المعزولة على منحدرات TSI و LIA آجار ، في خطوط على المنحدر وعن طريق ثقب في وسط الحبيبات.
 ملاحظة: قم بفك أغطية أنابيب وسائط TSI و LIA قليلاً قبل الحضانة للسماح بدخول الهواء ، وبالتالي تجنب السلبيات الكاذبة.
 5.5.2 افحص الخصائص العامة للسالمونيلا بعد الحضانة لمدة 24 ساعة عند 35.0 ± 1.0 درجة مئوية.
 - TSI: Alc / A (g)، (H2S)
 Alc: منحدر قلوي (أحمر)
 أ (ز): قاعدة صفراء (حمضية) مع أو بدون غاز (غ)
 (H2S): وجود أو عدم وجود H2S (أسود)
 - LIA: Alc / Alc، (H2S)
 Alc: تفاعل قلوي في المنحدر والقاعدة ، لونه بنفسجي
 (H2S): وجود أو عدم وجود H2S (أسود)
 5.5.3 يمكن أيضًا استخدام مجموعات التشخيص التجارية (مثل معارض API أو جهاز VITEK من Biomérieux) للحصول على ملف تعريف بيوكيميائي أكثر اكتمالاً.
 5.6 الأمصال
 5.6.1 المصل الجسدي متعدد التكافؤ
 يمكن إجراء هذا الاختبار على شريحة أو في أنابيب.
 􀂎 الشريحة التراص
 على شريحة زجاجية ، حدد المناطق S + (تحكم إيجابي) و S - (تحكم سلبي) و C (اختبار ثقافة).
 ضع قطرة من المحلول الفسيولوجي على كل منطقة من المناطق C و S + وقطرتان على المنطقة S -.

 من منحدر وسط كيميائي حيوي أو أجار مغذي ، قم بإزالة كمية كافية من الثقافة قيد الدراسة لتحضير معلق كثيف في المناطق C و S -.
 للتحكم الإيجابي S + ، استخدم ثقافة معروفة من السالمونيلا وقم بإعداد معلق كثيف.
 قم بإعداد المصل المضاد متعدد التكافؤ وفقًا لتوجيهات الشركة الصانعة وضع قطرة على المعلقات C و S +.
 باستخدام إبرة أو مقبض أو قضيب خشبي ، اخلطي المعلقات بشكل منفصل.  تتأرجح النصل لمدة 1 دقيقة.
 افحص الشريحة على خلفية داكنة من أجل التكتل الذي يحدث عادة في غضون دقيقة.  إن استخدام مجسم Darkfield مفيد للغاية.
 يمكن أن تحدث ردود فعل إيجابية كاذبة.  يمكن تصحيح الوضع عن طريق إجراء اختبارات إضافية باستخدام مضادات التجمّع الجسدية والمضادات المضادة للسوط.
 التراص في منطقة التحكم السلبية S - (التراص التلقائي) يبطل النتائج الإيجابية للمنطقة C.
 التراص في الأنابيب
 يمكن إجراء نفس عملية التراص باستخدام أنابيب زجاجية بدلاً من شريحة.  ثم نستخدم أنابيب (8 × 60 مم) ، أي أنبوب لـ C و S + و S -.
 ملحوظة: السيطرة على سلالة Salmonella ser.  يقدم Matopeni نتيجة سلبية مع مصل poly A - I & Vi.  إذا كانت النتيجة مع السلالة من العينة سلبية أيضًا ، فيجب فحصها باستخدام مصل مضاد أحادي التكافؤ O: 30 لتحديد ما إذا كانت السلالة ليست نتيجة التلوث المتبادل مع  سلالة السيطرة أثناء التلاعب في المختبر.
 5.6.2 بعد النتائج الحاسمة للاختبارات البيوكيميائية ، للجراثيم المختارة بواسطة مجموعة تجارية والاختبارات المصلية ، Salmonella spp.  على منحدر BHI من أجار MacConkey.  يجب إجراء المصل الكامل من قبل مختبر متخصص لهذا الغرض.

 6. التعبير عن النتائج
 إن عدم وجود مستعمرات مشبوهة في الأجار الانتقائي يعني أن العينات المقدمة للتحليل لم تحتوي على Salmonella spp.
 يتم التعبير عن النتائج على النحو التالي: غياب أو وجود Salmonella spp.  في 25 جرام من العينة.

 انظر الملحقين "أ" و "ب"

 12. ببليوغرافيا
 1. وزارة الصحة الكندية ، فرع حماية الصحة.  أوتاوا.  خلاصة وافية للطرق.  طيران.  2 ، MFHPB-20.  أبريل 1998 والملحق ي ، نوفمبر 2003. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment
 2. الهيئة الدولية للمواصفات الميكروبيولوجية للأغذية (ICMSF) ، 1988. الكائنات الدقيقة في الأطعمة ، المجلد 1. مطبعة جامعة تورنتو.
 3. A.O.A.C.  1990. طرق التحليل الرسمية ، الطبعة 15.  رابطة الكيميائيين التحليليين الرسميين ، أرلينغتون.  يذهب.
 4. إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، 1992. الدليل التحليلي البكتريولوجي ، الطبعة السابعة.  رابطة الكيميائيين التحليليين الرسميين ، أرلينغتون ، فيرجينيا.
 5. أندروز ، دبليو إتش وآخرون.  دليل التحليلي البكتريولوجي FDA.  1995 ، الطبعة الثامنة.  AOAC الدولية.  السالمونيلا ، ص.  5.01-5.20.
 6. أندروز ، WH 1995. الطرق الميكروبية ، ص.  1-119.  الطرق الرسمية لتحليل AOAC الدولية ، الطبعة السادسة عشر.  AOAC الدولية ، أرلينغتون ، فيرجينيا.
 13. الموافقة
 جينيت لابيريير ، عالمة ميكروبيولوجي
 كيم ويفر ، مدير الجودة لوحدة علم الأحياء الدقيقة
 بيريت كاردينال ، رئيس قسم الأحياء الدقيقة

أضيف بتاريخ 09 نوفمبر 2020  الساعة  11:18 مساء

عدد القراء 175

برمجة و تصميم الاحلام نت